ADN/ARN MICROARRAYS

ADN/ARN MICROARRAYS

jueves, 28 de marzo de 2019

OBJETIVO

Comprender los conceptos básicos de la técnica de Microarrays y cómo se aplica a la genómica funcional. Analizar las diferencias en la expresión génica utilizando un microarray de dos colores. Se analizarán cuatro conjuntos de muestras simuladas de pacientes para determinar diferentes niveles de expresión génica. Al final de la práctica, se habrá observado y analizado un experimento utilizando la técnica de Microarrays.

COMPONENTES

COMPONENTES	CONSERVACIÓN
Cuatro diferentes muestras de microarrays QuickStrips™
Paciente 1	Nevera
Paciente 2	Nevera
Paciente 3	Nevera
Paciente 4	Nevera
Tarjeta de microarrays	Nevera

NOTA: ESTE EXPERIMENTO NO CONTIENE NINGÚN MATERIAL PREPARADO A PARTIR DE FUENTES HUMANAS O DE VIRUS.

NOTA: ALMACENAR TODO EXPERIMENTO EN EL REFRIGERADOR DESPUÉS DE RECIBIRLO.

MATERIAL NECESARIO

• Pipeta de volumen fijo (5 μl)
• Puntas de pipeta estériles (amarillas)
• Transiluminador
• Placa de 96 pocillos microtiter
• Vaso de precipitados: contenedor de residuos
• Incubador de CO2
• Gafas de seguridad
• Guantes y bata

PROCEDIMIENTO DE LA PRÁCTICA

• Precauciones:
• Aunque no se utiliza ningún material humano en esta práctica,se deben usar guantes y gafas de seguridad en todo momento como buenas prácticas de laboratorio.
• Llevar gafas y guantes de laboratorio mientras se trabaja.
• No pipetear con la boca, como norma general. 
• Extremar las precauciones cuando se trabajan con equipos que utilizan conjuntamente calor y mezcla de reactivos.
• Lavarse las manos con jabón y agua después de haber trabajado en el laboratorio o utilizado reactivos o materiales biológicos.

• Introducción:

Antes de proceder a la realización de la práctica, mi grupo ha sido el encargado de supervisar la práctica de los otros grupos y con ello, hemos tenido que preparar el material necesario para cada uno de ellos.

•  En primer lugar, hemos cogido la placa de microarrays QuickStrip ™ del paciente 1 y hemos separado con unas tijeras cada microarray individual que la compone como indica el envase; de manera que obtengamos 5/7 microarrays individuales (una para cada grupo).

Nota: Asegurándonos de no perforar la lámina que cubre las muestras.

• Posteriormente, hemos procedido a marcar con un permanente un lado de cada una de estas microarrays individuales con una línea (en el caso del paciente 1). 
• Luego, hemos realizado el mismo procedimiento para las otras 3 placas de microarrays QuickStrip™, pero teniendo en cuenta a la hora de señalizarlas lo siguiente:

Paciente	Líneas
Paciente # 1	I
Paciente # 2	II
Paciente # 3	III
Paciente # 4	IIII

De manera que a cada microarray individual de la placa de microarrays del paciente 2 la marquemos con dos líneas a un lateral, a las de la placa del paciente 3 con tres líneas y las del paciente 4, con cuatro líneas.

• Cada grupo recibirá un conjunto de cuatro microarrays QuickStrips™ marcadas con un número de líneas según al paciente que corresponda (Una tira del paciente 1 con una línea, otra del paciente 2 con dos líneas, otra del 3 con tres líneas y otra del 4 con cuatro líneas). 
• Luego, golpear suavemente sobre la mesa de laboratorio los microarrays QuickStrips™ de los 4 pacientes, para asegurar que todas las muestras están en el fondo del pocillo. 
• Colocar los 4 microarrays individuales sobre la placa microtiter; preferiblemente dejando un espacio de entre 2 y 3 columnas de la placa entre microarray y microarray para evitar confusiones. 
• Se dará una tarjeta de microarrays para cada grupo. En la tarjeta, los puntos A-D representan muestras de control y los puntos E-H representan las muestras experimentales.

•  Material que debe recibir cada grupo:

• Cuatro tiras microarrays QuickStrips™ diferentes (marcadas con 1, 2, 3 y 4 líneas): 
• Una tira de muestra microarray con una línea: Paciente (#1).
• Una tira de muestra microarray con dos líneas: Paciente (#2).
• Una tira de muestra microarray con tres líneas: Paciente (#3).
• Una tira de muestra microarray con cuatro líneas: Paciente (#4).

• Tarjeta de microarrays.
• Pipeta fija (de 5 μl).
• Puntas de pipeta.
• Transiluminador.

• Realización de la técnica de microarrays:

1. Una vez que cada grupo tenga la tarjeta de microarrays y los cuatro microarrays QuickStrips™ individuales con las muestras de ADNc codificados para los pacientes 1, 2, 3 y 4 situados sobre la placa microtiter, se debe perforar la lámina protectora que cubre los pocillos, pipetear 5 μl y aplicar cada muestra de ADNc en los lugares debidamente identificados para cada paciente en la tarjeta.

Nota: Para perforar la lamina protectora del microarrays QuickStrips™ puede utilizarsela misma punta de pipeta, siempre teniendo cuidado de no perder la muestra que hay en el interior del pocillo.

Nota: Para evitar la contaminación de unas muestras con otras y resultados inadecuados, se debe utilizar una punta de pipeta para cada muestra/pocillo.

  

       2. Una vez completada la tarjeta de microarrays, colocarla en la incubadora de                    CO2 a 37ºC durante 5 minutos para permitir que las muestras se sequen.

       3. Visualizar los resultados de la tarjeta utilizando el transiluminador con luz UV de              onda larga.

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y ANÁLISIS
Realizar un cuadro en un folio como la tarjeta de microarrays y anotar los símbolos apropiados en cada caso en función de los colores que nos muestre la tarjeta de microarrays en el transiluminador. Para ello, es preciso conocer la clave de los resultados:

PREGUNTAS SOBRE EL EXPERIMENTO

Responder a las siguientes preguntas de la práctica:

1. ¿Qué nueva información se encuentra a nuestra disposición como consecuencia del proyecto del genoma humano?

Como resultado del Proyecto del Genoma Humano, se ha puesto a disposición del público una gran cantidad de información acerca de la secuencia de ADN.

Utilizando la información de la secuencia, se puede asignar la localización cromosómica de genes específicos, y en la actualidad todavía están siendo identificados nuevos genes.

Los datos del Proyecto del Genoma Humano ha demostrado que las secuencias de ADN sólo se diferencian,aproximadamente,en un 0,2% entre diferentes individuos. Variaciones específicas en el genoma de un individuo pueden ser utilizadas como marcadoras para predecir la predisposición para enfermedades particulares. Los científicos pueden analizar estas diferencias genéticas para explorar la diversidad humana y la evolución a nivel de la secuencia de ADN. Además, el genoma incluye secuencias de ADN que influyen en la producción de proteínas a través de otros mecanismos.

2. Explicar la tecnología básica detrás de microarrays y por qué es importante para la biotecnología y la medicina.

La aparición de la tecnología de microarrays de ADN ha hecho posible producir y analizar los datos de medición de los niveles de ARNm de miles de genes en un solo experimento.

Los Microarrays (o "chips de genes") han hecho posible identificar, clasificar y asignar funciones a muchos genes no caracterizados, simplemente mediante la determinación de cuando los genes se expresan o están reprimidos. Su pequeño tamaño y su capacidad para analizar la expresión de un gran número de genes simultáneamente han hecho de los microarrays una herramienta importante para la investigación genómica en diversos campos tales como el descubrimiento de fármacos, la toxicología y diagnóstico médico.
  
3. ¿Cómo se hacen las bibliotecas de ADNc?
Hay cuatro pasos básicos que intervienen en un microarray de dos colores (permite la comparación de los perfiles de expresión de dos muestras diferentes), entre los que destaca la síntesis de ADNc, en el que se generan bibliotecas de ADN complementario (ADNc) a partir de las muestras de ARN usando transcriptasa inversa (RT), una enzima que utiliza ARN como molde para producir ADN. Las bibliotecas de ADNc son etiquetados con sondas fluorescentes. El ADNc aislado de la muestra control es marcado con una etiqueta fluorescente verde normalmente, mientras que cDNA aislado de la muestra experimental se marca con un fluorescente rojo.
La biblioteca de cDNA control representa el nivel normal de expresión de genes en células de la piel.

4. ¿Qué información ha hecho posible los microarrays de ADN?
La información que ha hecho posible los microarrays de ADN es el conocimiento de que se han podido analizar los datos de medición de los niveles de ARNm de miles de genes en un solo experimento.

5. ¿Cómo identificamos y analizamos los puntos individuales en un chip de genes de microarrays?
El chip se escanea con un láser que excita los marcadores fluorescentes. La información de la fluorescencia en cada punto se recoge y se procesa mediante un programa especializado que crea una imagen en color de la micromatriz. La imagen se analiza utilizando un programa que interpreta la fluorescencia de cada punto.
El color y la intensidad de fluorescencia en cada punto permiten a los investigadores identificar diferencias genéticas clave.