SOUTHERN BLOT

SOUTHERN BLOT

4, 5 y 8 de abril de 2019

INTRODUCCIÓN

Es una técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o nylon.

Permite la detección simultánea de varias secuencias diana de distintos tamaños con una única hibridación.
Además, se usa como herramienta para una prueba de “huella genética” en un caso hipotético de determinación de paternidad.
Su nombre procede de la persona que lo diseñó Edwin Southern
Típicamente, se utilizan como sondas radiactivas, pero en este caso vamos a utilizar una detección no-isotópica para su uso escolar.

OBJETIVO
El objetivo de esta práctica consiste en adquirir conocimientos de una de las técnicas de hibridación utilizadas en el laboratorio, el Southern Blot. En este caso se utiliza como herramienta para una prueba de "DNA fingerprinting" (huella genética) en un caso hipotético de determinación de paternidad.
En esta práctica vamos a usar dos muestras de ADN de dos padres, las cuales han sido separadas previamente para realizar su digestión con las mismas enzimas de restricción.

MATERIAL NECESARIO
Conservación a -20ºC:

• A Fragmentos estándar de ADN
• B ADN madre cortado con enzimas de restricción
• C ADN hijo cortado con enzimas de restricción
• D ADN padre 1 cortado con enzimas de restricción
• E ADN padre 2 cortado con enzimas de restricció

Conservación a Tª ambiente:

• Practice Gel Loading Solution
• Tampón de electroforesis 50 X
• Bote de Blue - Blot DNA Stain Solution 10 X
• Membrana de Nylon 7 x 7 cm
• Papel de filtro para el bloting 7 x 7 cm
• Agarosa
• Pipetas de transferencia
• Pipetas de 1 ml estériles
• Probeta 100 ml

MATERIALES Y REACTIVOS NO INCLUIDOS EN EL KIT

• Aparato de electroforesis horizontal
• Fuente de energía para la electroforesis.
• Sistema de visualización del ADN
• Bandeja para la tinción.
• Baño de agua.
• Estufa o incubador 80ºC.
• Micropipetas automáticas y puntas.
• Microtubos y tubos de10 ml.
• Placa calefactora o microondas.
• Agua destilada
• NaCl.
• NaOH
• HCl concentrado.
• Plástico para envolver y papel secante.
• Pinzas

DESCRIPCIÓN

La mayoría de las aplicaciones del Southern Blot están siendo sustituidas por PCR, debido a que aporta mayor sensibilidad y rapidez.

Se obtuvo del kit ADN de 2 posibles padres, esas muestras de ADN fueron digeridas con la misma enzima de restricción en reacciones separadas. El objetivo de la prueba es determinar quién es el padre del hijo mediante el análisis y emparejar el patrón de fragmentación del ADN después de la electroforesis en gel de agarosa.

• El experimento se divide en 3 partes:
• Electroforesis en gel de agarosa
• Transferencia Southern Blot
• Detección del ADN

TIEMPO APROXIMADO PARA LAS PREPARACIONES

Para ello, la electroforesis debería pararse cuando el colorante naranja de carga haya migrado aproximadamente 4,5 cm desde el pocillo de siembra del gel de agarosa. Las preparaciones previas de reactivos se pueden hacer el día previo o el día de la práctica y puede llevar aproximadamente 1h 30’.
Se requieren 90 minutos para preparar los procedimientos de transferencia de Southern Blot, la cual tiene lugar durante toda la noche. Al día siguiente el blot se desmonta y se incuba durante 30 minutos.
La detección del ADN requerirá aproximadamente 25 minutos para la tinción y destinción.

PRECAUCIONES

• Llevar gafas y guantes de laboratorio mientras se trabaja.
• No pipetear con la boca
• Extremar las precauciones cuando se trabajan con equipos que utilizan conjuntamente calor y mezcla de reactivos.
• Lavarse las manos con jabón y agua después de haber trabajado en el laboratorio o utilizado reactivos o materiales biológicos.

PROCEDIMIENTO DE LA PRÁCTICA  

• 1. PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA:
• En primer lugar procedimos a la realización del gel de agarosa: 7 x 10 cm, debido a que el molde del protocolo (7 x 7 cm) no se encontraba disponible.
• Como la concentración del gel debía ser del 1 %, una parte de mis compañeros han disuelto 100 ml de tampón TBE 20X en 100 ml de agua destilada con ayuda de una probeta y una varilla agitadora.

• Posteriormente, alicuotamos 42 ml de tampón TBE en una probeta y pesamos en la balanza electrónica (con espátula y vidrio de reloj) 0'40 gramos de agarosa. Una vez obtenida la agarosa pesada, se la añadimos a los 42 ml de tampón TBE, removemos con la varilla agitadora y movemos la probeta circularmente con suavidad.

• Transferir la disolución a un matraz aforado y taparlo con papel de parafilm.
• Introducir el matraz en el microondas para disolver la agarosa hasta conseguir un punto de ebullición. Para ello, hemos requerido de 1 minuto, ya que transcurrido este tiempo, la disolución ya estaba transparente, y por lo tanto, lista.

Nota: A la hora de retirar el matraz del microondas, debemos ponernos un guante especial para evitar quemarnos.

• Debemos dejar enfriar la solución de agarosa hasta unos 55ºC.
• Una vez enfriada, vertemos la solución sobre el molde (el cual ha sido previamente preparado con los topes y con el peine, gracias al cual se formarán los pocillos).
• La solidificación del gel ha tardado sobre unos 25-30 minutos, metiéndolo por último unos minutos en la nevera para asegurarnos de que está bien frío.

• ELECTROFORESIS:
•  El grupo 6 fue el responsable de descongelar las muestras de ADN en el baño María a unos 65ºC durante 2 minutos antes de su siembra y de su posterior alicuotado.

Nota: Para ello, es importante marcar bien los tubos microeppendorf que contienen las muestras de ADN con la letra que le corresponde a cada paciente.

•  Transferimos el gel de agarosa ya solidificado a la cubeta de electroforesis, con los pocillos orientados hacia el lado negativo (cable negro de la fuente de alimentación). Para ello, se llena la cubeta con tampón de carga hasta que éste llegue a cubrir el gel.
• Un error que tuvimos, fue que en el protocolo ponía que en cada pocillo debían sembrarse 35-38 µl, pero ha resultado ser que los pocillos que hemos hecho nosotros con el peine, no son lo suficientemente grandes para contener esta cantidad, por lo que acabaron por salirse de los pocillos del gel.
• Por tanto, se empleó el otro gel de agarosa que habíamos hecho (teníamos 2 geles) y finalmente optamos por aplicar 10 µl por pocillo.

Nota: cada vez que cambiamos de muestra con la pipeta para introducirla en los pocillos, se deben usar puntas de micropipetas diferentes para cada una de ellas.

•   Una vez colocadas las muestras en los pocillos, tapamos la cubeta de electroforesis con la tapa y la conectamos a la fuente de alimentación.
•  Se configura la fuente de alimentación a un voltaje de 150 V durante unos 35 minutos.

  2. ANÁLISIS DEL SOUTHERN BLOT
Durante este proceso transferimos los fragmentos de ADN desde el gel de agarosa hasta la membrana de naylon. Después de la trasferencia, la membrana será incubada durante un periodo corto de tiempo para fijar el ADN a la membrana. Para evitar reactivos tóxicos,y especialmente los radioactivos,que son utilizados en el Southern, en este experimento se utilizará un sistema de detección no isotópico. El proceso es el siguiente:

• Sacamos el gel de la cubeta de electroforesis y lo depositamos sobre papel absorbente.
• Introducimos el gel con cuidado de que no se rompa en una cubeta previamente preparada con 100 ml de 0'25 N HCl (de manera que cubra bien el gel). Esta cubeta la hemos situado sobre una placa agitadora y la hemos puesto en funcionamiento durante unos 8 minutos.

• Retiramos la solución de 0'25 N de HCl de la cubeta y le echamos agua destilada para limpiar el gel. Posteriormente, se repite el proceso de llenado de la cubeta con agua varias veces.
• Colocar el gel durante 15 minutos en la solución desnaturalizadora de ADN (0'5 M  NaOH/ 0,6 M NaCl).El gel debe estar cubierto con la solución y agitarlo suavemente con el empleo de la placa agitadora. Eliminar la solución.
• Remojar el gel en una segunda solución desnaturalizadora de ADN de otros 100 ml durante 15 minutos.
• Guardar el gel en la nevera hasta el próximo día.

3. CONFIGURAR LA TRANSFERENCIA DEL SOUTHERN BLOT

• Recuperar el gel de agarosa que habíamos depositado en la nevera el último día de la práctica.
• Cogimos una cubeta e hicimos un puente utilizando para ello un molde de gel de agarosa.
• Cubrimos el puente con un papel llamado Whatman de forma que sobre por los lados de éste para que esté en contacto con el tampón TaE 10 X previamente depositado en la cubeta.
• Utilizando una varilla agitadora, le quitamos las arrugas al papel y colocamos sobre él un papel de filtro. Una vez colocado, volvemos a alisar dicho papel.
• Colocamos encima el gel de agarosa con los pocillos orientados hacia abajo.
• Humedecemos la membrana con solución desnaturalizadora utilizando una pipeta Pasteur.
• Introducimos las membranas en una cubeta con solución de desnaturalización durante 5 minutos.
• Ponemos encima del gel de agarosa dos membranas de naylon (debido a que son necesarias las dos para cubrir totalmente el gel).
• Para coger las membranas utilizamos pinzas ya que el ADN no se unirá a las zonas que hayamos tocado con los dedos.
• Colocamos papel de filtro sobre la membrana y ponemos unas bayetas encima.
• Sobre éstas, además colocamos una placa de cristal y dos pesas.

La transferencia se realizará durante los 3 días que no tenemos clase.

El próximo día de clase, hemos continuado con la práctica y hemos realizado el siguiente procedimiento:

• Comprobar que todo el conjunto está humedecido por el tampón TAE 10X con la consiguiente desecación del gel.
• Voltear el conjunto gel-membrana-papel de filtro.
• Marcamos los pocillos de gel en la muestra con un rotulador.
• Con unas pinzas, retirar el gel de la membrana.
• Colocamos la membrana sobre dos papeles de filtro y la introducimos en la estufa a 80ºC durante 30 minutos.

4. DETECCIÓN NO ISOTÓPICA DEL ADN.

• Durante este proceso se podrá visualizar el ADN en la membrana.

• Para la detección empleamos el Blue Blot DNA Stain, para ello, colocamos la membrana con el ADN en 100 ml de la solución diluida de Blue Blot DNA Stain durante 10-15 minutos.

• Sacamos la membrana de ese recipiente con ayuda de unas pinzas y la colocamos en 200 ml de agua destilada.

• Cambiamos el agua destilada 3 o 4 veces hasta que la membrana quedó desteñida y las bandas de ADN se hicieron algo visibles.

5. RESULTADOS
En la imagen podemos observar que el pocillo 1 (marcador de peso molecular) no se visualiza; los siguientes 3 pocillos sí pueden visualizarse (ADN de la madre, ADN hijo y ADN padre 1 respectivamente). En cambio, el 5º pocillo no se puede visualizar (ADN padre 2).

6. PREGUNTAS PREVIAS

1. ¿Por qué el Southern Blot es un análisis requerido para pruebas forenses o de paternidad? 
La digestión de los cromosomas humanos con enzimas de restricción produce gran cantidad de fragmentos de ADN que no pueden ser separados por electroforesis convencional. Además, los geles son difíciles de almacenar y frágiles para exponer a agentes desnaturalizantes. La transferencia de las bandas de ADN a una membrana de nylon produce una imagen espejo de los fragmentos de ADN. De esta forma los fragmentos transferidos a la membrana pueden ser desnaturalizados.

    2. ¿Cuál es la función de las sondas en el análisis de paternidad? 
Se trata de sondas específicas pueden ser desarrolladas para determinar la presencia de los lugares de restricción. Las sondas pueden hibridar con uno o más fragmentos generados por los enzimas de restricción.

  3. ¿Por qué se utiliza más de un locus en un test de paternidad? 
Se utilizan varias sondas para asegurar que el test determina diferentes diferencias alélicas en un individuo dado que se puede correlacionar con la suma tanto de su padre y su madre.

  4. ¿Cuál es el padre en esta prueba de paternidad?
 Padre 1. 

  5. ¿Se demuestra que la madre también es la madre biológica? 
Sí.